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I 型鼠尾胶原是经过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备的。

 

I 型鼠尾胶原蛋白可用于包被细胞培养器皿,培养一些在普通细胞培养器皿中不易贴壁的细胞,也可用于制备三维胶,模拟真实的生长环境,使细胞在三维环境中生长。

 

I 型鼠尾胶原包被板铺板的操作:首先要在消毒实验室,包括超净台,紫外消毒20-30分钟,消毒后30分钟进入实验室,事先准备三蒸水,经高压灭菌处理。


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生物材料用于诊断、治疗、修复或替换机体组织器官,或增进其功能,可以是人造的、天然的,也可以是两者的结合。因此,良好的生物材料不仅要求材料具有良好的理化性能,更要求具有良好的生物相容性,且能和肌体永久协调。

I型胶原是构成细胞外基质的骨架结构,能与细胞相互作用并影响细胞的形态、骨架组装及增殖与分化;能与细胞周围的基质有良好的相互作用,表现出相互影响的协调性,并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。随着材料科学与技术的发展,以及细胞生物学和分子生物学的进展,I型胶原基生物材料的发展已进入一个崭新的阶段。

I型胶原蛋白独特的纤维状结构及良好的生物性能,使其成为生物材料领域的热门研究课题。近年来,国内外已成功将I型胶原基生物材料应用于骨组织工程、血管组织工程、人工皮肤及其他生物学领域。


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对以往I型胶原蛋白提取做出改进后的方法。

方法:取鼠尾浸入75%酒精消毒30min,移入PBS液中洗2次,去皮、抽取鼠尾腱,放入PBS液中洗2次,高速组织粉碎机粉碎后放入3%醋酸(每尾200mL),48h1.2g离心2h。吸取上清加入30%浓盐水40mL盐析。离心4000g30min。将沉淀溶入50mL0.1%醋酸内,置透析袋内与500mL1 mmol/LHCl透析48h,其间换水5次。这样可得到透明清亮的胶原溶液。加入015mL氯仿,敞开瓶口,用无菌纱布包住,置无菌工作台48h使氯仿挥发。取5mL溶液经 SEXTRYTM冷冻干燥机冷冻干燥,定量胶原浓度为3.5g/L

    常用I型胶原的提取一般采用多次超速离心的办法。经改进,本法只进行了2次超速离心,减少了步骤。一般在I型胶原的提取过程中要不断使用不同浓度的NaCl/0.05mol.L1TrisHCl缓冲液,反复进行离心、抽提。本方法将其改为在3%醋酸的酸性条件下,直接加入40mL30%浓盐水。不仅减少了步骤,还节省了试剂和时间。


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胶原蛋白是人体内含量最多的一种蛋白质,占人体全身总蛋白质的30%以上,一个成年人的身体内约有3千克胶原蛋白,广泛地存在于人体的皮肤、骨骼、内脏、血管、肌腱、软骨、关节中,起着支撑、修复、保护的三重作用。

但是,随着年龄的增长,人体内的胶原蛋白会逐渐流失。胶原蛋白的流失导致支撑皮肤的胶原肽键和弹力网断裂,其螺旋网状结构随即被破坏、皮肤组织被氧化、萎缩、塌陷、肌肤就会出现干燥、皱纹、松弛无弹性等衰老现象。

胶原蛋白肽在医疗领域中被广泛用于人工角膜、烧伤的敷料、手术时预防粘连的薄膜、止血剂、手术用线、人工血管等产品。目前市场上可食用的胶原蛋白产品中,大部分都用的都是经酶酵解的小分子的胶原蛋白肽。

近年来,人们主要关注胶原蛋白在皮肤美容方面的应用,不少化妆品和功能性食品都将含有胶原蛋白作为卖点。实际上,随着对胶原蛋白认识的不断深入,人们发现,胶原蛋白肽对增加骨密度、减轻关节疼痛、减少紫外线伤害、改善脆甲症等方面都有着重要的作用。


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人类身体内部大约含有500万种类是蛋白质,其中约30%~40%是胶原蛋白,它从外表看起来像细长纤维状的一种物质,那么这细长锁链状的胶原蛋白是从哪里来的呢?

答案是在细胞中制造出来的。那么是不是所有的细胞都能制造呢?并非如此,它仅仅是由纤维芽细胞、软骨细胞、骨芽细胞、肌芽细胞等制造出来的。人体内的细胞运作都进行着精密的分工体制,各司其责,各自在体内采取精密合理的分工,合作来完成人体生理机能运作。

制造胶原蛋白材料,由18种基本氨基酸构成,这些氨基酸是由口腔吃入各种蛋白食物之后,进入人体消化系统吸收,再由肝脏加以分解,精制出来的胶原蛋白送入血液循环,输送到个细胞使用。一旦体内缺乏这三条件之一,三条一组的螺旋状在中途形成就会胡乱,胶原成份会组合不好,体内各处器官需求部分就会呈现松散状态,构造强度就会混乱,所呈现出来的是骨形发育不好、坏血病等及其它方面的一些关节障碍的毛病。


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一、低免疫原性

胶原作为医用生物材料,最重要的特点在于其低免疫原性,与其他具有免疫原性的蛋白质相比,胶原蛋白的免疫原性非常低。人们甚至曾认为胶原不具有抗原性,研究表明:胶原具有低免疫原性,不含端肽时免疫原性尤其低。

二、相容性

生物相容性是指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。胶原本身是构成细胞外基质的骨架,无论是在被吸收前作为新组织的骨架,还是被吸收同化进入宿主成为宿主的一部分,都与细胞周围的基质有着良好的相互作用,表现出相互影响的协调性,并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。

三、可降解性

胶原能被特定的蛋白酶降解,即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结构,所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链,只有胶原酶、弹性蛋白酶等特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解胶原蛋白。可生物降解性是胶原蛋白能作器官移植材料被利用的基础。

四、凝血性

胶原具有促进血小板凝聚和血浆结块的止血性能,止血活性依赖于胶原聚集体的大小和分子的天然结构。胶原可以与血小板通过粘合、聚集形成血栓起到止血的作用。


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I型鼠尾胶原是借鉴Navneeta Rajan, Jason Habermehl法,经过乙酸抽提、离心、灭菌、透析等步骤制备得到的高纯度、高活性胶原蛋白,属于医药级别产品,可用于包被细胞培养器皿(单分子层包被),适合多种类型细胞的贴壁如肝脏细胞、神经节细胞、胚胎细胞、肌细胞、肺细胞、神经鞘细胞等。

黑龙江力海鑫生物科技股份有限公司开发生产的I型胶原蛋白包被细胞培养板,规格为6孔板、12孔板、24孔板等,表面经I型鼠尾胶原蛋白包被,易于细胞贴壁,可以很好的降低蛋白质的吸附。使用这种细胞培养板培养细胞,可以获得良好的细胞贴壁率,细胞增殖速度快,形态均一,细胞培养成功率高。

本品适用于普通的细胞培养、细胞贴附性测试、受体配对研究、细胞基质研究、信号传导研究、形态学研究等。


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1、心脏瓣膜

目前已发展的心脏瓣膜有机械瓣膜和生物瓣膜。用胶原基材料制成的生物瓣膜的缺点是植入人体后会产生钙化。

2、血管修复

与合成材料相比,生物材料的多样性为改善置换器的性能提供了有利条件,并且胶原基装置还具有感染性低、宿主组织能向装置中渗入生长,而不需要高密度孔结构,以及可与天然血管在物理性质上较好的匹配等优点。

3、可溶性胶原

其对软组织的扩增、恢复,特别是对矫正各种皮肤断面缺陷非常有用,还可用于食管包括肌声带的修复、牙周方面的治疗。

4、创伤、烧伤修复材料

能诱导分化及成纤维细胞的趋化性,延迟伤口收缩,加速创伤修复。

5、胶原止血剂

胶原与血小板作用后,引起后继的与血液聚集相关联的一系列过程的进行,从而可迅速凝血。作为止血剂使用的胶原,可以是粉状、扁状及海绵状等多种物理形态。

6、明胶

胶原经温和水解而产生肽键的不可逆断裂后,所得的主要产物是明胶。明胶对多种皮肤病均有治疗作用,其用于手足皲裂、皮肤瘙痒、鱼鳞病等皮肤病,效果非常显著。

7、人工皮肤

人工皮肤是第一个面市的组织工程材料的商品,其一般方法是先从某种含有胶原的原材料中提取胶原,经过酶消化、纯化,制成胶原的分散液,再向其中加入其它物质,均匀混合制成胶原膜。

8、固定化酶载体和胶囊

胶原蛋白分子肽链上具有多种反应基团,如羟基、羧基和氨基等,易于吸收和结合多种酶和细胞,实现固定化,它具有与酶和细胞亲合性好、适应性强的特点。另外胶原是一种成膜性好的物质,并具有生物相容性,在体内可被逐步吸收,因此,胶原蛋白固定化晦特别适合于人工应用材料。

9、胶原膜

胶原不仅可以保护和促进角膜上皮细胞的生长,而且还可作为“药膜”,使在结膜囊内的药物逐渐释放入眼内,从而在短时间内在眼内达到较高浓度,并维持较长时间,还可减少药物的毒性,具有广阔的发展前景。


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胶原蛋白是生物高分子,动物结缔组织中的主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白,占蛋白质总量的25%~30%,某些生物体甚至高达80%以上。胶原蛋白种类较多,常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型,而Ⅰ型胶原蛋白是组织分布最为广泛的胶原蛋白。因其具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物活性,被广泛的应用于食品、医药、组织工程、化妆品等领域。

1、在食品中的应用

胶原蛋白在食品中有两方面的应用:一是功能,二是营养。利用胶原蛋白的成膜性,可将其作用于固化酶的膜材料和肉食品标签,也可作为食品粘合剂合成纤维膜,用作肉类、鱼类等的包装纸。此外,它还可以作为食品保护层,具有抗氧化性,可保持肉食品的颜色鲜亮。

2、在医药中的应用

由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度,又有可吸收性,在使用时既有优良的血小板凝聚性能,止血效果好,又有较好的平滑性和弹性缝合结头不易松散,不易损伤机体组织。还可用于血浆的代用品、人造皮肤、人工血管、骨的修复和人工骨和固定化酶的载体。

3、美容与保健

胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用,可广泛应用于美容、美肤、美发用品中。

4、在其他工业的应用

制革工艺过程中剩下的废弃物中含有丰富的胶原蛋白,可以提取出来用作饲料的动物蛋白资源,实现资源利用,同时今年来胶原蛋白在造纸工业、制革工业等轻工业中也有越来越多的应用。


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I型胶原基生物材料是白色或类白色海绵状固体,溶于酸溶液,具有高纯度、高活性、低免疫性、生物可降解性等特性。

I型胶原基生物材料的应用

1、骨组织材料

骨组织材料是天然的或人工合成或组织工程化的,用于骨组织缺损修复的重要材料。在软骨组织工程中,I型胶原以凝胶形式的应用已经有广泛的研究。Weiser等将牛软骨细胞植入胶原凝胶,证实I型胶原凝胶为软骨细胞提供了一个三维空间,软骨细胞可分化产生细胞基质。武和明等研究发现I型胶原凝胶可作为骨髓基质细胞的细胞外基质,复合骨髓基质细胞修复骨缺损。 Mizuno等将I型胶原凝胶与干细胞分化的软骨细胞复合修复关节软骨大块、全厚缺损取得成功。陈富林等将软骨细胞与I型胶原凝胶复合后体外观察到软骨细胞可在胶原凝胶中充分伸展,生长良好,植入体内2个月成功再造出软骨组织。 Wakitani等用嵌入软骨细胞的I型胶原蛋白凝胶来修复软骨缺陷。

2、血管组织材料

血管组织工程是在体外构建有生理活性的血管移植物,将细胞种植于三维血管支架上,使之粘附、分化、生长,并分泌细胞外基质,来培养具有生命力的血管材料,为外科血管移植开辟一条新的源泉。

3、人工皮肤材料

工皮肤材料是采用组织工程技术构建人工皮肤替代物,以达到暂时性乃至永久性替代自身皮肤的作用,理想的人工皮肤应是与人体皮肤结构和组成一致的、有生物活性的蛋白复合材料。


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I型胶原蛋白(也称胶原)是一种多糖蛋白质,呈白色,含有少量的半乳糖和葡萄糖,是细胞外基质的主要成分。胶原蛋白是一个庞大的家族,种类繁多,结构高度复杂,从分子结构、超分子结构,再到组织分布和功能等,具有显著的多样性。在蛋白胶原众多的家族成员中,I型胶原蛋白是被人们了解得最为清楚的、也是组织分布最为广泛的胶原蛋白,它在动物体内的组织分布主要在皮肤、骨、角膜、肌腱、肿瘤。III型胶原蛋白则主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道。

I 型胶原和 III 型 胶原蛋白与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关。正常婴儿皮肤 III 型胶原占 80%,随着生长发育,III 型胶原不断减少,I 型胶原不断增加。成人皮肤胶原组成为 I 型占 80%,III 型占 20%。在合成 ECM 过程中,婴儿肌体与成年机体比较:婴儿皮肤的Ⅲ型胶原蛋白比Ⅰ型胶原蛋白值高出80%。婴儿无瘢痕愈合机制是由于婴儿皮肤较强的 III 型胶原的合成能力。在创伤修复过程中,从骨髓来源的干细胞分化成的成纤维细胞起着关键的核心作用能合成 III 型胶原蛋白。

简单来说,I型胶原蛋白是相对坚硬的胶原蛋白,III型胶原蛋白是具有弹性的胶原蛋白。

婴儿皮肤中III型胶原蛋白的含量占到80%以上,因此具有优异的弹性和修复功能。成人皮肤中的III型胶原蛋白因为年龄的增加流失而减少,同时成人真皮已经不具有合成III型胶原蛋白的能力,只能合成I型胶原蛋白,因此像伤口的愈合经常会留下瘢痕。

随着年龄的增大,III型胶原蛋白的流失越来越快,尤其25岁以后,皮肤中III型胶原蛋白的合成速度赶不上流失速度,最终导致皱纹、松弛等衰老现象。


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